電車で一人分だけあいてて歳下30代彼氏が（私40代）「主ちゃん座り」言われたので 「なんで。年寄り扱いみたい」「なんで。膝痛めてるからだよ。20代の子でも今日

彼氏さんが正しいと思います。
席を譲ってくれた方としては、空席ひとつで目の前で言い合うのを見ていられなかったんでしょう。
そこでさらに「いやいやそんな〜」とかのやりとりは、相手の方も望んでないと思いますよ。
既に周辺の乗客を微妙な気分にさせていたのだと思うので、素直に感謝して速やかに座るのが一番です。

でもその前に揉めてなくて、主さんが素直に「ありがとう」ってひとり座ってたんなら話は別かな。
その場合は「ありがとうございます、でもお気遣いなく」でいいと思う。
普通は主さんがさっと座ってれば、別にほかの方も席を譲りはしないだろうけど。